从个人学术性实验室到大型的医药制造企业，小型或者大规模的蛋白纯化通常都需要几种类型的液相色谱仪。这些相关的大部分技术已应用了多年，但是新型柱料的发展为这些利用蛋白物理和化学特性进行分离的，经过时间考验的方法注入了新的力量。其中**值得提到的就是...
关键词：蛋白离子交换分离分子物质树脂
从个人学术性实验室到大型的医药制造企业，小型或者大规模的蛋白纯化通常都需要几种类型的液相色谱仪。这些相关的大部分技术已应用了多年，但是新型柱料的发展为这些利用蛋白物理和化学特性进行分离的，经过时间考验的方法注入了新的力量。其中**值得提到的就是凝胶过滤层析技术（gel filtration，gf），离子交换层析技术（ion exchange，iex），羟基磷灰石层析（hydroxyapatite，hap）和疏水作用层析（hydrophobic interaction，hi)，以及亲和层析和高效液相色谱方法（high-performance liquid chromatography，hplc）。 对于一个初接触蛋白纯化的新手而言，从哪儿下手也许是令人头疼的一件事，但是幸运的是目前这些流程都已经逐步系统化了。ge healthcare（原amersham biosciences）的技术顾问andrew mitchell解释道，通常利用液相色谱技术进行蛋白纯化有三步： 捕获——从细胞其它成份，比如dna和rna中分离需要的蛋白；
区分——从与目的蛋白具有相近的大小，或者相似的物理/化学特征的污染物中分离蛋白；
修饰——使分离得到的样品处于可使用状态。
这每一个纯化的步骤都有特定的色谱层析技术和**佳的beads大小。
**步捕获步骤，也就是从细胞裂解物粗成份中分离蛋白，这需要一个具有高容量和高流量（flow rate）的填料。bead大小比较大，范围比较宽（比较于bead大小平均值）的“fast flow”填料比较理想，这种填料也有利于防止目标蛋白被水解——因为速度比较快。 第二步则对分辨率要求更高，需要更好的从混合物中分离需要的成份。通常bead的大小与分辨率成反比，因此在这一部中比较小的bead比较合适。吸附性的技术，比如离子交换iex和疏水作用hi通常被用在纯化的这前两个步骤，而凝胶过滤则会留到了**后的修饰那一步，用于小体积，高浓度的样品。另外要注意，进行凝胶过滤层析时，样品的体积应该保持在柱床体积的1%到4%。
选择柱料的时候有两个因素要考虑到，针对目的蛋白的选择性和有效性——这些可以由洗脱峰的宽度来说明。其中选择性主要是指填料与目的蛋白相互作用以及结合的能力，iex和hi层析方法就是指目标分子与筛分介质之间的相互作用，而gf的选择性依赖于填料的分馏范围（fractionation range）。
柱料的有效性则是指层析介质洗脱样品得到显著层析峰的能力，mitchell表示，“如果你的峰值不集中，比较宽，那么即使是选择性很好，分辨率仍然会被消弱”。bead越大，洗脱峰就越不集中，柱子的有效性就越低。纯化洗脱相近的蛋白需要高效性，高选择性和高效性的结合就会得到高分辨率。
凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)
凝胶过滤法（gel filtration）也称为排阻层析（exclusion chromatography）、凝胶层析（gel chromatography）或分子筛层析（molecular sieve chromatofraphy），它是在1960年后发展出来的技术。
凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，内部具有网状筛孔，利用球状凝胶内的筛孔，使分子流过填充凝胶的管柱时，大分子无法进入凝胶筛孔，而只流经凝胶及管柱间的孔隙，很快就可以流出管柱，较小的分子因为进入凝胶内的筛孔，故在管柱内的停留时间较长，由此区分大小不同的分子，亦可与已知大小的分子作比较而定出一分子的分子量。一般状况下，凝胶不会吸附成份，所有欲分离物质都会被洗出，这是凝胶层析法与其它层析法不同的地方。 目前常用的凝胶包括3个主要类型： 1. polydextran
polydextran的商品名称是sephadex，它几乎不溶于溶剂中，亲水性强，能迅速在水和电解质溶液中膨胀，在碱性的环境中十分稳定，所以可以用碱去除凝胶上的污染物。sephadex依其吸水量有不同型号，如 g-25、g-75、g-100或是g-200，g 后面的数字为凝胶吸水量再乘以10，以g-25为例，表示1克干燥的g-25凝胶可以吸水2.5 ml。
ge的sephadex g-25柱就是这一系的产品，十分适合于快速处理不同体积的样品，可以用在层析纯化的前、中、后的任一阶段，即适用于实验室操作，也可以在生产上应用。达柱体积30％的样品可通过简单的一次性上柱，脱盐并转换道新的缓冲液中，一些不需要的低分子量的物质，如盐分子就被洗脱了，这种产品**大的特点就是高速和高容量，处理起样品来快速高效。 2. polyacrylamide
polyacrylamide是一种合成凝胶，商品名bio-gel p，干粉颗粒状，在溶剂中自动溶成胶体，依胶的分离范围不同，分成bio-gel p-2**bio-gel p-300，p后面的数字乘以1000为**大过滤限度。polyacrylamide的化学性质不活泼，但它在极端的ph 下会被水解，水解后产生的cooh-具有离子交换的性质，因此ph 值应尽量控制在2-10之间。 3. agarose
商品名separose，属于天然凝胶，依凝胶中干胶的百分含量，分为sepharose 2b，4b和6b。agarose gel 是一种大孔凝胶，主要用于像核酸或病毒这些分子量400,000以上的物质，因其颗粒软，在分离过程有时会阻塞管柱，造成流速减慢，又因其在摄氏50度以上会融化，故需于较低温的环境中进行层析。agarose 做成beads后不能再脱水干燥，所以要在湿态中保存。
